Контробрешетка под профлист: Контробрешетка под профнастил: нужна ли?

Контробрешетка под профнастил: нужна ли?

Крыша служит защитой нашего дома, посему к ее обустройству следует подходить очень тщательно, внимательно, не отступая от правил монтажа. Одной из особенностей монтажа крыши является обустройство контробрешетки. Как сделать контробрешетку под профнастил, какие нюансы у этого этапа возведения крыши, а также – какие функции выполняют обрешетка и контр брусья? Об этом речь далее.

Содержание

• 1 Различия между обрешеткой и контробрешеткой
• 2 Функции контробрешеток
• 3 Выбираем древесину
• 4 Устанавливаем контр брусья

Различия между обрешеткой и контробрешеткой

Не все понимают предназначение контрреек, поэтому часто путают их с обрешеткой. Однако функции этих элементов кровельного пирога несколько отличаются. Чтобы разобраться, в чем же отличие, следует описать эти конструктивные элементы.

Внимание!!! Наши читатели считают, что утренняя рыбалка — миф! Раскрыт секрет улова, необходимо всего лишь растворить 1 пакетик в 0,5 литрах воды читать далее.

..

Устройство кровли

Обрешетку составляют ряды из досок, которые прибиваются на стропильную систему. Она может быть сплошной или разряженной. Шаг между досками в сплошной обрешетке составляет менее сантиметра. Такая конструкция позволяет изолировать шум, удерживать тепло. Разряженные обрешетки чаще применяются на кровлях из профнастила. Сооружаются они из брусьев размерами 50х50 миллиметров. Обрешеточные доски прибиваются на контробрешетку гвоздями.

Контробрешетка выполняется из деревянных брусьев, набиваемых на стропила, непосредственно на гидроизоляцию. Контр брусья обеспечивают циркуляцию воздуха между водонепроницаемой пленкой, обрешеткой и профилированными листами.

Нередко на покрытии, внутри, образовывается конденсат, что в итоге приводит к гниению всей кровельной конструкции. Контр брусья выступают не просто каркасом для обрешетки, способствуют выводу влаги. Контробрешетка делается из брусьев, у которых сечение 30х50 мм.

Функции контробрешеток

Ни для кого не секрет, что перед укладкой профнастила крыша покрывается пленкой, предназначенной для защиты от влаги. Поэтому контр брусья – необходимое условия обустройства кровли. Объясним. Между полотном гидроизоляции и обрешеткой обязательно необходимо оставлять зазор вентиляции. Этот зазор можно обеспечить посредством монтажа контрреек.

http://www.youtube.com/watch?v=VO_XRw_Fb1k

Актуальнее всего применение контрбрусьев на пологих крышах. Также без нее не обойтись в случае применения профнастила с волновой высотой до 21 миллиметра. В обоих случаях есть риски провисания кровельного материала. Поэтому, перестраховываясь, строители делают под профнастил на таких крышах частую или сплошную обрешетку. Это требует обустройства дополнительного зазора между обрешеткой и гидроизоляцией. Добиться его можно с помощью контр брусьев. На контробрешетку возлагаются следующие функции:

1. Обеспечивает создание вентиляционного зазора (он должен составлять 5 сантиметров)
2. Способствует тому, чтобы гидроизоляционная пленка не соприкасалась с досками обрешетки. Дело в том, что на пленке гидроизоляции нередко скапливается конденсат. Благодаря контробрешетке он свободно стекает по пленке, не вредя деревянным элементам крыши.
3. Контробрешеткой под профнастил обеспечивается распрямление материала гидроизоляции, благодаря чему он не провисает.

Какими бывают обрешетки

Есть и другие функции у контр брусьев. К примеру, если небрежно обтесать стропила, их можно выравнять перед монтажом основной обрешетки путем набития дополнительных планок. Кроме того, контробрешетку можно использовать в качестве опоры для временных, монтажных обрешеток, которые актуальны для строителей для передвижения по крыше, устеленной гидроизоляцией. В этом случае контр брусья не позволят повредить или порвать гидроизоляцию.

Советуем прочитать: обрешетка под профлист

Выбираем древесину

Какое дерево более всего подойдет для обустройства контрреек? Этим вопросом задаются многие строители, особенно те, которые не являются профессионалами. В первую очередь выбор материала зависит от того, какую кровлю вы выберите, вернее, из какого материала она будет возведена. Так, если вы планируете делать крышу из тяжелых металлов, идеальным решением станет выбор сосны или дуба.

При перекрытии крыши легкими материалами (как в нашем случае – профнастилом), используется мягкая древесина. По высоте система из контрреек варьируется от двух до пяти сантиметров.

Устанавливаем контр брусья

Произвести установку контр брусьев совершенно не сложно. После укладки и закрепления гидроизоляционного слоя, параллельно основным стропилам набейте планки-бруски, которые следует заранее подготовить. При чем работать следует очень аккуратно, иначе существует риск повреждения гидроизоляционной пленки.

При выборе планок отдайте предпочтение тем, которые по длине немного больше метра. Рассчитать длину каждого брусочка можно так, чтобы на высоту кровли приходилось три брусочка, зазоры между ними должны составлять 15-30 сантиметров.

Бруски контробрешетки вполне удобны для обустройства угла конька кровли. Для этого просто запилите верхушки планок так, чтобы они образовывали кровельный угол. И на него уже производите монтаж конька. Это значительно облегчает работу по формированию конькового уголка основными стропилами.

Как видим, соорудить устройство не составляет труда, не требует дополнительных затрат. При этом она выполняет много функций. Посему не игнорируйте обустройство контробрешетки и не обходите стороной данный этап строительства крыши.

Как сделать контробрешётку и обрешётку для крыши под профнастил?

Содержание:

1. Контробрешётка под профнастил.
2. Шаговая обрешётка для профнастила.
3. Усиливаем обрешётку под элементы отделки и элементы безопасности.

• Монтируем обрешётку в ендове.
• Монтируем обрешётку на коньке.
• Монтируем обрешётку на торцах кровли.
• Монтируем обрешётку под кровельным ограждением.
• Монтируем обрешётку под снегозадержатели.

Итог

Поговорим о том, на чём держится кровельный материал ― о каркасе крыши. Он состоит из стропил, контробрешётки и обрешётки. На стропилах заострять внимание не будем, расскажем более подробно про обрешётку и контробрешётку.

Контробрешётка ― это бруски, смонтированные вдоль стропил. Обрешётка ― доски, уложенные поперёк.

Контробрешётка и обрешётка

Расскажем более подробно о том, зачем нужны обрешётка и контробрешётка, из чего и как их монтировать. Рассмотрим оба элемента в связке, потому что только обрешёткой под профнастил вы не обойдётесь.

Контробрешётка под профнастил

Что это

Контробрешётка ― это деревянные бруски 50х50 мм (иногда используют 32х50 мм).

Напоминаем: о том, как выбрать древесину для подконструкции, читайте в статье «Контробрешётка и обрешётка: как выбрать материал». Не забудьте обработать дерево противопожарными составами и растворами от гнили и насекомых.

Зачем нужна

1. Для проветривания всех слоёв кровельного пирога. Благодаря контробрешётке и шаговой обрешётке между профнастилом и гидроизоляцией образуется зазор. Воздух попадает в него и свободно циркулирует в подкровельном пространстве. Все слои кровельного пирога вентилируются, влажный воздух не застаивается, утеплитель (если он есть) и деревянные стропила не отсыревают.
2. Для фиксации гидроизоляционной плёнки или мембраны. Брусок, прикрепленный к стропилам, надёжно «держит» полотно гидрозащиты.

Когда монтируют

После установки стропил и гидроизоляции.

Как монтируют

1. Уложите гидроизоляционную плёнку или мембрану поверх стропил.
2. Закрепите гидроизоляцию на капельнике (это стальная планка, по которой скатывается конденсат). Используйте двустороннюю соединительную ленту.
3. Поверх гидроизоляции прямо на стропила положите бруски 32х50 или 50х50 мм. Они должны располагаться вертикально (вдоль стропил). Соедините их со стропилами ― прибейте гвоздями или прикрутите саморезами.

Шаговая обрешётка для профнастила

Что это

В целом, обрешётка может быть сплошной и шаговой (разреженной). Первая представляет собой сплошной «ковёр» из досок или фанеры, в нашем случае она не подходит. Для профнастила используют шаговую обрешётку, поэтому будем говорить только о ней.

Шаговая обрешётка ― это доски, уложенные на контробрешётку не вплотную друг к другу, а на определённом расстоянии.

Обычно выбирают доски 32х100 мм, иногда используют 50х100 мм. Они обязательно должны быть ровными.

Зачем нужна

1. Для равномерного распределения нагрузки на подконструкцию.
2. Для повышения несущей способности стропил.
3. Для создания ровной плоскости. Тогда листы профнастила правильно лягут на основание и герметично состыкуются.

Когда монтируют

После монтажа контробрешётки.

Как монтируют

Шаг обрешётки под профнастил

Шаговую обрешётку для профнастила монтируют горизонтально.

Доски укладывают поперёк контробрешётки и фиксируют саморезами или гвоздями. Их укладывают не вплотную, а на расстоянии 500 мм друг от друга.

Если расстояние между стропилами (иначе говоря, шаг стропил) больше 1 м, желательно сделать обрешётку более частой, чтобы она надёжно «сцепила» стропила и сделала всю конструкцию прочнее. Но универсального совета нет ― потребуется точный расчёт. Обратитесь к специалистам, они вычислят, какой надо сделать шаг обрешётки под профнастил. Он зависит от шага стропил, угла наклона крыши, марки профлиста и т. д.

Усиливаем обрешётку под элементы отделки и элементы безопасности

Мы рассмотрели, как сделать контробрешётку базовую шаговую обрешётку под профнастил. Но на крыше есть места, где обрешётку необходимо усилить или модифицировать:

• в ендове;
• на торцах кровли;
• на коньке;
• под снегозадержателями и кровельным ограждением.

Рассказываем более подробно.

Монтируем обрешётку в ендове

Обрешётка в ендове

Ендовой называют место, где два ската сходятся и образуют внутренний угол.

Как видно на картинке, в ендове делают сплошную обрешётку. Важный нюанс: её монтируют раньше, чем шаговую. Порядок монтажа таков:

• сначала ― контробрешётка;
• потом ― сплошная обрешётка;
• затем ― шаговая.

Сплошная обрешётка в ендове необходима, т. к. нижняя планка ендовы должна опираться на капитальное основание. Это позволит усилить ендову, и она выдержит нагрузку, которая на неё приходится (скопление снега и воды).

Как сделать сплошную обрешётку в ендове:

• На контробрешётку устанавливают доски сплошной обрешётки 32х100 мм. Их 6 штук ― по 3 слева и справа от центра ендовы. Доски обрешётки надо монтировать не впритык, а с просветом около 5 мм. Тогда они не будут вытеснять друг друга при расширении.
• После этого на контробрешётку укладывают шаговую обрешётку. Она состоит из таких же досок ― 32х100 мм.

Монтируем обрешётку на коньке

Конёк ― это внешний стык скатов. Если мы говорим о двускатной кровле, это её самая верхняя часть.

Конёк оформляют с помощью коньковой планки. Чтобы создать прочное основание под неё, шаговую обрешётку на коньке усиливают. Для этого над верхней доской шаговой обрешётки набивают дополнительную доску.

Обрешётка под конёк

Монтируем обрешётку на торцах кровли

На торца крыши нужно набить дополнительные доски. Они должны быть той же высоты, что и волны профнастила.

На картинке изображена металлочерепица, но принцип тот же.

Обрешётка на торцах

Монтируем обрешётку под кровельным ограждением

Обрешётка под кровельное ограждение

Под кровельное ограждение также нужно сделать крепкое основание. Этот элемент безопасности должен выдерживать вес человека, а значит, его надо прочно зафиксировать на крыше. Поэтому между досками шаговой обрешётки монтируют 3дополнительные  доски. Их укладывают с зазором 50 мм.

Напоминаем: кровельное ограждение монтируют выше уровня карнизного свеса.

Монтируем обрешётку под снегозадержатели

В месте крепления снегозадержателя нужно смонтировать дополнительную доску. В противном случае «снежок» просто не получится прикрепить к подконструкции ― у него недостаточно широкая опора.

Расстояние между дополнительной и основной досками зависит от шага обрешётки под профнастил и от типа «снежка» (поскольку у них разные кронштейны).

Представим, что у вас сделана обрешётка под профлист с шагом 500 мм. В этом случае расстояние между дополнительной и основной досками будет:

• 350 мм ― если вы монтируете СЗТ-150 ROOFRetail;
• 400 мм ― если вы устанавливаете СЗТ-150.

Обрешётка под СЗТ-150 ROOFRetailОбрешётка под СЗТ-150

Напоминаем: «снежки» устанавливают выше уровня карнизного свеса.

Итог

Контробрешётка и шаговая обрешётка под профнастил ― два базовых элемента крыши. Они образуют основу, на которую укладывают кровельный материал. Сделать полноценную крышу из профлиста без контробрешётки или обрешётки невозможно ― их надо использовать в комплексе.

Покупайте только качественные ровные бруски и доски, обрабатывайте их антипиренами и средствами от насекомых и плесени. Соблюдайте шаг обрешётки под профнастил, усиливайте её там, где это требуется ― на торцах, в ендове, на коньке, под «снежками» и кровельным ограждением.  

Ошибки при монтаже приведут к тому, что профнастил будет сложно выровнять и состыковать. Если материал плохо зафиксирован, листы будут вибрировать от ветра, также могут разболтаться саморезы. Крыша не будет надёжной, её сможет сорвать даже сильный порыв ветра.

Следуйте нашим советам ― и вы сделаете прочный каркас для долговечной кровли.

Как сделать контробрешётку и обрешётку для крыши под профнастил?

Содержание:

1. Контробрешётка под профнастил.
2. Шаговая обрешётка для профнастила.
3. Усиливаем обрешётку под элементы отделки и элементы безопасности.

• Монтируем обрешётку в ендове.
• Монтируем обрешётку на коньке.
• Монтируем обрешётку на торцах кровли.
• Монтируем обрешётку под кровельным ограждением.
• Монтируем обрешётку под снегозадержатели.

Итог

Поговорим о том, на чём держится кровельный материал ― о каркасе крыши. Он состоит из стропил, контробрешётки и обрешётки. На стропилах заострять внимание не будем, расскажем более подробно про обрешётку и контробрешётку.

Контробрешётка ― это бруски, смонтированные вдоль стропил. Обрешётка ― доски, уложенные поперёк.

Контробрешётка и обрешётка

Расскажем более подробно о том, зачем нужны обрешётка и контробрешётка, из чего и как их монтировать. Рассмотрим оба элемента в связке, потому что только обрешёткой под профнастил вы не обойдётесь.

Контробрешётка под профнастил

Что это

Контробрешётка ― это деревянные бруски 50х50 мм (иногда используют 32х50 мм).

Напоминаем: о том, как выбрать древесину для подконструкции, читайте в статье «Контробрешётка и обрешётка: как выбрать материал». Не забудьте обработать дерево противопожарными составами и растворами от гнили и насекомых.

Зачем нужна

1. Для проветривания всех слоёв кровельного пирога. Благодаря контробрешётке и шаговой обрешётке между профнастилом и гидроизоляцией образуется зазор. Воздух попадает в него и свободно циркулирует в подкровельном пространстве. Все слои кровельного пирога вентилируются, влажный воздух не застаивается, утеплитель (если он есть) и деревянные стропила не отсыревают.
2. Для фиксации гидроизоляционной плёнки или мембраны. Брусок, прикрепленный к стропилам, надёжно «держит» полотно гидрозащиты.

Когда монтируют

После установки стропил и гидроизоляции.

Как монтируют

1. Уложите гидроизоляционную плёнку или мембрану поверх стропил.
2. Закрепите гидроизоляцию на капельнике (это стальная планка, по которой скатывается конденсат). Используйте двустороннюю соединительную ленту.
3. Поверх гидроизоляции прямо на стропила положите бруски 32х50 или 50х50 мм. Они должны располагаться вертикально (вдоль стропил). Соедините их со стропилами ― прибейте гвоздями или прикрутите саморезами.

Шаговая обрешётка для профнастила

Что это

В целом, обрешётка может быть сплошной и шаговой (разреженной). Первая представляет собой сплошной «ковёр» из досок или фанеры, в нашем случае она не подходит. Для профнастила используют шаговую обрешётку, поэтому будем говорить только о ней.

Шаговая обрешётка ― это доски, уложенные на контробрешётку не вплотную друг к другу, а на определённом расстоянии.

Обычно выбирают доски 32х100 мм, иногда используют 50х100 мм. Они обязательно должны быть ровными.

Зачем нужна

1. Для равномерного распределения нагрузки на подконструкцию.
2. Для повышения несущей способности стропил.
3. Для создания ровной плоскости. Тогда листы профнастила правильно лягут на основание и герметично состыкуются.

Когда монтируют

После монтажа контробрешётки.

Как монтируют

Шаг обрешётки под профнастил

Шаговую обрешётку для профнастила монтируют горизонтально.

Доски укладывают поперёк контробрешётки и фиксируют саморезами или гвоздями. Их укладывают не вплотную, а на расстоянии 500 мм друг от друга.

Если расстояние между стропилами (иначе говоря, шаг стропил) больше 1 м, желательно сделать обрешётку более частой, чтобы она надёжно «сцепила» стропила и сделала всю конструкцию прочнее. Но универсального совета нет ― потребуется точный расчёт. Обратитесь к специалистам, они вычислят, какой надо сделать шаг обрешётки под профнастил. Он зависит от шага стропил, угла наклона крыши, марки профлиста и т. д.

Усиливаем обрешётку под элементы отделки и элементы безопасности

Мы рассмотрели, как сделать контробрешётку базовую шаговую обрешётку под профнастил. Но на крыше есть места, где обрешётку необходимо усилить или модифицировать:

• в ендове;
• на торцах кровли;
• на коньке;
• под снегозадержателями и кровельным ограждением.

Рассказываем более подробно.

Монтируем обрешётку в ендове

Обрешётка в ендове

Ендовой называют место, где два ската сходятся и образуют внутренний угол.

Как видно на картинке, в ендове делают сплошную обрешётку. Важный нюанс: её монтируют раньше, чем шаговую. Порядок монтажа таков:

• сначала ― контробрешётка;
• потом ― сплошная обрешётка;
• затем ― шаговая.

Сплошная обрешётка в ендове необходима, т. к. нижняя планка ендовы должна опираться на капитальное основание. Это позволит усилить ендову, и она выдержит нагрузку, которая на неё приходится (скопление снега и воды).

Как сделать сплошную обрешётку в ендове:

• На контробрешётку устанавливают доски сплошной обрешётки 32х100 мм. Их 6 штук ― по 3 слева и справа от центра ендовы. Доски обрешётки надо монтировать не впритык, а с просветом около 5 мм. Тогда они не будут вытеснять друг друга при расширении.
• После этого на контробрешётку укладывают шаговую обрешётку. Она состоит из таких же досок ― 32х100 мм.

Монтируем обрешётку на коньке

Конёк ― это внешний стык скатов. Если мы говорим о двускатной кровле, это её самая верхняя часть.

Конёк оформляют с помощью коньковой планки. Чтобы создать прочное основание под неё, шаговую обрешётку на коньке усиливают. Для этого над верхней доской шаговой обрешётки набивают дополнительную доску.

Обрешётка под конёк

Монтируем обрешётку на торцах кровли

На торца крыши нужно набить дополнительные доски. Они должны быть той же высоты, что и волны профнастила.

На картинке изображена металлочерепица, но принцип тот же.

Обрешётка на торцах

Монтируем обрешётку под кровельным ограждением

Обрешётка под кровельное ограждение

Под кровельное ограждение также нужно сделать крепкое основание. Этот элемент безопасности должен выдерживать вес человека, а значит, его надо прочно зафиксировать на крыше. Поэтому между досками шаговой обрешётки монтируют 3дополнительные  доски. Их укладывают с зазором 50 мм.

Напоминаем: кровельное ограждение монтируют выше уровня карнизного свеса.

Монтируем обрешётку под снегозадержатели

В месте крепления снегозадержателя нужно смонтировать дополнительную доску. В противном случае «снежок» просто не получится прикрепить к подконструкции ― у него недостаточно широкая опора.

Расстояние между дополнительной и основной досками зависит от шага обрешётки под профнастил и от типа «снежка» (поскольку у них разные кронштейны).

Представим, что у вас сделана обрешётка под профлист с шагом 500 мм. В этом случае расстояние между дополнительной и основной досками будет:

• 350 мм ― если вы монтируете СЗТ-150 ROOFRetail;
• 400 мм ― если вы устанавливаете СЗТ-150.

Обрешётка под СЗТ-150 ROOFRetailОбрешётка под СЗТ-150

Напоминаем: «снежки» устанавливают выше уровня карнизного свеса.

Итог

Контробрешётка и шаговая обрешётка под профнастил ― два базовых элемента крыши. Они образуют основу, на которую укладывают кровельный материал. Сделать полноценную крышу из профлиста без контробрешётки или обрешётки невозможно ― их надо использовать в комплексе.

Покупайте только качественные ровные бруски и доски, обрабатывайте их антипиренами и средствами от насекомых и плесени. Соблюдайте шаг обрешётки под профнастил, усиливайте её там, где это требуется ― на торцах, в ендове, на коньке, под «снежками» и кровельным ограждением.  

Ошибки при монтаже приведут к тому, что профнастил будет сложно выровнять и состыковать. Если материал плохо зафиксирован, листы будут вибрировать от ветра, также могут разболтаться саморезы. Крыша не будет надёжной, её сможет сорвать даже сильный порыв ветра.

Следуйте нашим советам ― и вы сделаете прочный каркас для долговечной кровли.

Трехмерная интерферометрическая решетчатая световая визуализация

Новые результаты

Bin Cao, Guanshi Wang, Jieru Li, Alexandros Pertsinidis

DOI: https://doi. org/10.1101/2020.08.27.266999

• Полный текст
• . ИСТОРИЯ/ИСТОРИЯ
9
• Полный текстовый
• Preview PDF

Abstract

Для понимания клеточной структуры и функций требуется визуализация живых клеток с высоким пространственно-временным разрешением и высокой чувствительностью обнаружения. Таким образом, прямая визуализация молекулярных процессов с использованием методов одиночной молекулы/сверхвысокого разрешения была революционной. Однако извлечение 4D-информации с самым высоким разрешением из слабых и динамических сигналов флуоресценции в живых клетках остается сложной задачей. Например, некоторые из методов с самым высоким пространственным разрешением, т.е. интерферометрический (4Pi) приближается к ^1-6 может быть медленным, требовать высоких пиковых интенсивностей возбуждения, которые ускоряют фотообесцвечивание или страдать от увеличения фона вне фокуса. Избирательное плоскостное освещение (SPIM) ^7-12 уменьшает фон, но большинство реализаций обычно имеют скромное пространственное, особенно осевое, разрешение. Здесь мы разрабатываем трехмерную интерферометрическую решетчатую визуализацию светового листа (3D-iLLS), метод, который преодолевает многие из этих ограничений. 3D-iLLS обеспечивает, благодаря SPIM, низкий уровень освещенности и фотообесцвечивание, обеспечивая при этом повышенное подавление фона и значительно улучшенные возможности объемного изображения/сечения с помощью интерферометрии 4Pi. Мы демонстрируем 3D-iLLS с осевым разрешением и точностью локализации одной частицы до <100 нм (FWHM) и <10 нм (1σ) соответственно. 3D-iLLS прокладывает путь к более полному выяснению субклеточных явлений за счет улучшенного 4D-разрешения и изображения SNR в реальном времени.

Интерферометрические (4Pi) подходы ^1-6 обеспечивают самое высокое на сегодняшний день трехмерное пространственное разрешение и точность локализации одной частицы: <100 нм и <10 нм вдоль z соответственно. Точечное сканирование 4Pi ¹ с сфокусированным возбуждением и конфокальным обнаружением обеспечивает наиболее эффективную 3D PSF с точки зрения уменьшения боковых лепестков, а также уменьшения фона. Однако точечное сканирование имеет ограниченное временное разрешение при отображении больших полей, а короткое время пребывания пикселя требует высокой пиковой интенсивности возбуждения, что часто ускоряет фотообесцвечивание. Интерферометрические установки с широким полем зрения, в принципе, могут обеспечить более быстрое получение изображения при уменьшенной пиковой интенсивности. Однако такие установки обычно реализуются в конфигурации эпи-освещения 9.0026 2-6 , который страдает от повышенного нерезкого фона. Таким образом, приложения были ограничены относительно разреженными и яркими ячеистыми структурами с низким фоном. Есть много систем, в которых представляющие интерес структуры могут включать только ∼10 молекул ^3,13 . Такие структуры трудно визуализировать в присутствии часто преобладающего клеточного фона ¹³ . Подход, который может одновременно достичь высокого 3D-разрешения и точности локализации, а также уменьшить фоновое/фотообесцвечивание, значительно улучшит наши возможности визуализации молекулярных структур и движений в нанометровых масштабах в высокофоновой, переполненной внутриклеточной среде.

Селективное плоское освещение (световой лист) освещает только тонкий срез образца, преодолевая многие ограничения эпи-освещения. В самых простых реализациях одна плоскость освещается лучом возбуждения, который перпендикулярен оптике обнаружения. Традиционным выбором для создания профиля избирательного плоского освещения является гауссовский пучок, который может проецироваться отдельной линзой объектива возбуждения, установленной перпендикулярно линзе обнаружения 9.0026 10 , или отражается от изготовленного из микрофибры консольного зеркала, установленного на линзе объектива возбуждения напротив линзы обнаружения ⁹ . В любом случае необходимо учитывать компромисс между толщиной светового листа и эффективным полем зрения из-за дифракции, и выбирать золотую середину в зависимости от требований исследуемого образца. Чтобы преодолеть ограничения из-за дифракции гауссовых лучей, недифракционные лучи, такие как Bessel ^8,11 или Airy ¹² можно использовать балки. Как один луч ¹¹ , так и массив лучей Бесселя ⁸ можно сканировать для создания светового листа, который тоньше, чем то, что достигается с помощью гауссова луча. Тем не менее, заметные боковые лепестки возбуждения вдали от плоскости основного освещения вносят избыточный фон и ненужное фотообесцвечивание на участках образца, находящихся вне фокуса, которые не отображаются. Селективное плоское освещение на основе связанных двумерных оптических решеток, освещение решетчатого светового листа (LLS) может подавлять боковые лепестки, сохраняя при этом свойство недифракции и тонкий профиль светового листа ⁷ . Микроскопия LLS продемонстрировала комбинированную низкую фототоксичность, низкое фотообесцвечивание и низкий фон, что хорошо подходит для исследований визуализации живых клеток. В традиционной визуализации LLS с одной возбуждающей линзой с числовой апертурой 0,7 и одной детектирующей линзой с числовой апертурой 1,1 достигается разрешение 240 нм × 240 нм × 380 нм ⁷ , в то время как для приложений локализации отдельных частиц типичная точность локализации составляет ^7,14 . ∼20 нм в xy и ∼45 нм в z . Эта производительность z значительно ниже, чем то, что может быть достигнуто с помощью интерферометрических методов, но, к сожалению, возможно, из-за ограничений геометрии двойного оппозитного объектива, было сложно реализовать подходы селективного плоскостного освещения в интерферометрических установках, чтобы в дальнейшем уменьшить фон и увеличить достижимое 3D-разрешение.

Здесь мы сообщаем об интерферометрическом методе визуализации для высокочувствительной визуализации живых клеток, который заменяет исходную схему эпи-освещения схемой селективного плоскостного освещения на основе оптических решеток (LLS-освещение). Этот новый метод визуализации 3D-интерферометрической решетчатой ​​световой пластины (3D-iLLS) обеспечивает более ограниченный объем обнаружения, чем обычная микроскопия LLS с одним объективом обнаружения, и, следовательно, меньше расфокусированного фона и более высокое отношение сигнал-шум. . Уменьшенный фон, более высокая эффективность использования фотонов и более высокие возможности оптического секционирования 3D-iLLS позволяют визуализировать слабые субклеточные структуры. Мы демонстрируем достижимое z разрешение <100 нм (FWHM) и точность локализации <10 нм (1σ), что в 4 раза лучше, чем у обычного LLS.

Чтобы лучше понять и оптимизировать микроскопию 3D-iLLS, мы разрабатываем конвейер численного моделирования (дополнительное примечание; дополнительный рисунок 1) для расчета результирующих 3D PSF на основе расчетов электромагнитного векторного поля. Общие 3D-iLLS PSF демонстрируют разные профили по сравнению с обычной микроскопией LLS (дополнительная фигура 2). В 3D-iLLS с конструктивной интерференцией излучения ФРТ имеет максимум в центре общего фокуса двух объективов с двумя дополнительными видимыми боковыми лепестками вдоль z -ось. При деструктивной интерференции излучения максимумы интенсивности располагаются симметрично вдоль оси z вдали от фокальной плоскости с двумя менее выраженными боковыми лепестками. В обоих случаях объем, занимаемый общими PSF для обнаружения 4Pi, в ≈2 раза меньше, чем для обнаружения 2Pi, что указывает на меньший фон и, следовательно, на более высокую чувствительность при отображении одиночных молекул и других слабых объектов в фокальной плоскости.

Наш микроскоп 3D-iLLS (рис. 1 a ; На дополнительном рисунке 3) используются две противоположные линзы обнаружения с числовой апертурой 1,1 в ранее описанной схеме интерферометрического резонатора ³ . Для визуализации интерферометр настраивается на положение нулевой длины пути, что приводит к конструктивной/деструктивной интерференции на двух портах светоделителя. Третья линза с числовой апертурой 0,7, ортогональная двум противоположным линзам обнаружения, обеспечивает возбуждение LLS. Мы калибруем экспериментальный 3D-iLLS PSF, используя 40-нм флуоресцентные шарики (рис. 1 b ). Калибровки эксперимента повторяют наши численные расчеты, показывая ожидаемую модулированную PSF с центральным лепестком FWHM ~ 100-140 нм, тем самым демонстрируя успешную реализацию желаемых оптических свойств 3D-iLLS. Должна быть возможна дальнейшая оптимизация (дополнительный рисунок 4) путем исправления остаточных аберраций как в путях обнаружения, так и в путях возбуждения, которые, скорее всего, ограничивают производительность текущего инструмента.

Рис. 1. Принципы 3D-iLLS, схема оптической установки и сравнение свойств PSF 3D-iLLS и обычного LLS.

a , Схема экспериментальной установки. ExL: файлы возбуждения; EmL1,2: линзы для обнаружения излучения. М1-7: зеркала. BS: неполяризующий светоделитель. ПЗМ: пьезоэлектрическая монтировка (фазовращатель). Cam0,1: камеры обнаружения sCMOS. TL: тубусная линза. F: фильтры выбросов. AOTF: Акустооптический настраиваемый фильтр. PBS: поляризационный светоделитель. SLM: пространственный модулятор света. AM: кольцевая маска. FL: линза с преобразованием Фурье. РЛ: релейные линзы. Врезка: геометрия и система координат между линзами. б , Экспериментальная калибровка обычных ФРТ LLS и 3D-iLLS с использованием флуоресцентных шариков 40 нм. Возбуждение: 642 нм; эмиссионный фильтр: 700/70м.

Для проверки эффективности 3D-iLLS с клеточными образцами мы визуализировали отдельные мРНК в клетках остеосаркомы человека (U-2 OS) ¹³ . Отдельные мРНК метят стволовыми петлями, полученными из фага PP7 (24 × PP7), и визуализируют с помощью тандемного димерного белка оболочки фага, слитого с Halo-tag (tdPCP-Halo), и окрашивая лигандом Halo-tag JF-646. 3D-iLLS адекватно разрешала одиночные мРНК даже в плотных кластерах, где обычная LLS не удавалась (рис. 2.9).0082 и ). Далее мы количественно оценили осевое разрешение, измерив профиль z отдельных мРНК. В то время как полученное разрешение на полувысоте составляет 444 ± 80 нм (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 4) для обычного LLS, z-профили 3D-iLLS дают разрешение на полувысоте 96 ± 10 нм (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 4). (Рисунок 2 б ). Эти результаты демонстрируют ≈4-кратное улучшение осевого разрешения 3D-iLLS по сравнению с обычным LLS.

Рис. 2 3D-iLLS превосходит обычную LLS в трехмерной субклеточной визуализации.

a , Сравнение 3D-iLLS и обычного LLS для визуализации мРНК 24×PP7, помеченных tdPCP-Halo-JF646, в фиксированных клетках U-2 OS. xy и yz максимальные проекции проекции. b , z профили одиночных мРНК (пунктирные линии) и аппроксимации пиков по Гауссу 1D (сплошные линии), демонстрирующие повышенное осевое разрешение для 3D-iLLS по сравнению с обычным LLS. c , 3D-iLLS-изображение кластеров Brd4 в живых мЭСК. Показан один срез z из необработанных данных. Звездочка отмечает реперную точку бусины. На вставках показаны отдельные z срезов для кластера, указанного желтой стрелкой (данные 3D-iLLS, 20 нм z шагов). d , z профили (с вычетом фона) одиночных кластеров Brd4, полученные с помощью обычных LLS и 3D-iLLS. Сплошные линии: нелинейный метод наименьших квадратов соответствует 1D-гауссовым пикам для обычного LLS и уравнениям вида

для 3D-iLLS для Cam0 и Cam1 соответственно. Данные в c, d являются необработанными данными без деконволюции. Данные в a, b показаны после деконволюции.

Чтобы продемонстрировать эффективность нашей установки 3D-iLLS при визуализации живых клеток, мы визуализировали эмбриональные стволовые клетки мыши (мЭСК), которые были сконструированы с помощью SNAP-метки, нокаутированной в эндогенном локусе Brd4 ¹³ . Ранее мы показали, что Brd4 образует фокусы, содержащие ∼15 меченых молекул на энхансерах генов Pou5f1 и Nanog ¹³ . Наша 3D-iLLS визуализация показывает множественные кластеры Brd4 по всему ядру мЭСК (рис. 2 c ), предполагая обширную кластеризацию Brd4 на энхансерах mESC. 3D-iLLS разрешает кластеры Brd4 с повышенным разрешением по сравнению с обычным LLS (рис. 2 d ). 3D-iLLS также может локализовать центр масс кластеров Brd4 в реконструированных клеточных объемах с точностью локализации ≈10 нм z (дополнительный рисунок 5). Эти результаты подчеркивают возможности 3D-iLLS для визуализации живых клеток.

Хотя такие объекты, как кластеры Brd4, могут быть локализованы в реконструированных 3D-iLLS клеточных объемах, визуализация последовательных оптических срезов на 9Сканирование 0034 z снижает скорость. Некоторые приложения, такие как визуализация на основе локализации отдельных молекул и отслеживание отдельных частиц, требуют быстрого определения трехмерных координат в узком диапазоне фокальной плоскости с субдифракционной точностью. Такие измерения локализации могут значительно выиграть от уменьшенного фона в схемах освещения селективной плоскости, но обычная микроскопия LLS с одним объективом обнаружения и осевое обнаружение на основе астигматизма может достигать только ~ 40-50 нм z точность локализации ^{7, 14, 15} . Мы считаем, что примерно в 10 раз более эффективная эффективность использования фотонов ³ интерферометрической локализации по сравнению с локализацией на основе астигматизма и в 2 раза более высокое отношение сигнал-шум 3D-iLLS по сравнению с обычной LLS должны повысить точность локализации 3D-нанометров до менее 10 нм. режим.

Чтобы использовать 3D-iLLS для повышения точности локализации z , мы внедряем модуляционную интерферометрию ³ , метод, который ранее достиг ~1-2 нм z Точность локализации. Мы извлекаем положение z , динамически модулируя длину одного из плеч интерферометра и измеряя фазу последующей модуляции интенсивности (рис. 3 a и дополнительный рисунок 6 a ). Ранее модуляционная интерферометрия основывалась на когерентности двух встречных возбуждающих лучей. Здесь мы вместо этого полагаемся на когерентность испускаемых флуоресцентных фотонов. Важно отметить, что для интерференции излучения два порта светоделителя интерферометра смещены на ≈90° относительно друг друга, что позволяет одновременно измерять две фазы на двух камерах обнаружения соответственно. Мы используем этот эффект, чтобы улучшить временное разрешение модуляционной интерферометрии в 2 раза (рис. 3 b и дополнительный рисунок 6 b ). Используя комбинированные фазы камер 0 и 1 с 6-фазным или 4-фазным циклом модуляции, наша установка 3D-iLLS обеспечивает точность локализации ≈2 нм и ≈8 нм z соответственно (рис. 3 c, d и дополнительный рисунок 6 c , d ). Эта характеристика «разомкнутого контура» без какой-либо активной стабилизации указывает на кратковременную механическую стабильность конструкции 3D-iLLS в режиме <10 нм. 3D-iLLS и модуляционная интерферометрия также позволили успешно отслеживать трехмерное перемещение одиночных мРНК 24×PP7, помеченных tdPCP-Halo-JF646, в цитоплазме живых клеток U-2 OS (рис. 3 e ). Эти результаты показывают, как 3D-iLLS можно также использовать для динамического трехмерного отслеживания одиночных частиц в живых клетках.

Рис. 3 3D-iLLS и модуляционная интерферометрия обеспечивают улучшенную осевую локализацию и трехмерное отслеживание отдельных частиц.

a-d , Осевая локализация с помощью 3D-iLLS и интерферометрии с 6-фазной модуляцией. a , Сигналы от 40-нм шарика на камерах 0 и 1, более 100 6-ступенчатых циклов модуляции. Шаг пьезоэлектрического фазовращателя составляет 121,67 нм, что соответствует 0°, 60°, 120°, 180°, 240° и 300° относительных фаз. Правая панель: увеличенная пунктирная область на левой панели, иллюстрирующая антикоррелированную модуляцию сигнала Cam0 по сравнению с Cam1. b , Сигналы от Cam0 и Cam1 объединяются в один цикл модуляции, удваивая временное разрешение. Правая панель: увеличение пунктирной области на левой панели. c , Наложение всех 200 циклов модуляции путем свертывания оси x в интервале [0-2π], демонстрирующее превосходную стабильность и воспроизводимость установки. Сплошная линия: соответствует синусоиде. d , Извлеченная фаза и координата z , показывающая σ _z ≈2 нм среднеквадратичное значение точность локализации. e , 3D-отслеживание отдельных мРНК в живых клетках U-2 OS с использованием 3D-iLLS и интерферометрии с 4-фазной модуляцией. Шаг пьезоэлектрического фазовращателя составляет 182,5 нм, что соответствует относительным фазам 0°, 90°, 180° и 270°. Сигналы Cam0 и cam1 объединяются для извлечения координат z . См. Также дополнительную фигуру 6. Верхние панели: молекула мРНК, совершающая в основном случайное броуновское движение; нижние панели: молекула мРНК, ограниченная объемом ~ 20 нм среднеквадратичного значения. радиус в 3D.

Наши результаты подтверждают, что 3D-iLLS является универсальным методом с улучшенной объемной визуализацией скученных клеточных образцов. Возможны дальнейшие разработки. 3D-iLLS и модуляционная интерферометрия ³ также могут улучшить трехмерную визуализацию сверхвысокого разрешения на основе локализации, при этом уменьшенный фон особенно полезен при визуализации плотно меченых образцов ¹⁴ . Адаптивная оптика ¹⁶ для коррекции аберраций, вызванных системой и образцом, может еще больше оптимизировать интерферометрические свойства ФРТ, уменьшая осевую протяженность ФРТ обнаружения и возбуждения, а также лучше согласовывая ФРТ обнаружения для повышения когерентности. Эти оптимизации могут дополнительно уменьшить осевые боковые лепестки интерферометрического ФРТ со значительным выигрышем для приложений деконволюции ¹⁷ . Кроме того, быстрая адаптивная оптика, такая как деформируемые зеркала, на пути обнаружения также позволит корректировать хроматические аберрации в реальном времени, что является важной предпосылкой для многоцветной визуализации 3D-iLLS. Наконец, наш дизайн может быть дополнительно расширен путем введения дополнительных линз возбуждения ¹⁸ и реализации схем микроскопии структурированного освещения (SIM) ^{4, 19} для возможной 3D-iLLS-SIM живых клеток с изотропным 3D-разрешением менее 100 нм.

Методы

Установка микроскопа 3D-iLLS

Установка 3D-iLLS построена на активно стабилизированной платформе виброизоляции (TMC, Stacis iX) внутри помещения с регулируемой температурой. Микроскоп 3D-iLLS состоит из пути возбуждения LLS, ортогонального оптической оси двух противоположных детекторных линз в интерферометрическом расположении 4Pi. Мы используем специальный объектив для возбуждения с числовой апертурой 26,7×0,7 (Special Optics, 54-10-7) и два объектива для обнаружения с числовой апертурой 25×1,1 (Nikon, MRD77225).

Путь обнаружения

Первая линза детектирования устанавливается на трехмерном изгибающем столике, приводимом в действие дифференциальными микрометрами (Thorlabs, MBT616D). Вторая линза обнаружения установлена ​​на трехмерном изгибаемом предметном столике, оснащенном дифференциальными микрометрами и дополнительными пьезоэлектрическими приводами с обратной связью (Thorlabs, MAX301). Дополнительный столик с ходом 50 мм, приводимый в действие шаговым двигателем (Thorlabs, LNR50S), используется для грубого позиционирования второй линзы обнаружения. Путь интерферометрического обнаружения аналогичен нашей предыдущей установке модуляционной интерферометрии 9.0026 3 , включая моторизованную платформу для грубого сканирования длины пути и пьезоэлектрический фазовращатель для точной настройки/быстрой модуляции (Physik Instrumente, S-303. CD с контроллером E-709.CHG). Флуоресцентные лучи от двух детектирующих линз интерферируют на неполяризующем светоделителе, а свет от двух выходных портов фильтруется с помощью четверных режекторных фильтров (Semrock, StopLine NFO3-405/488/561/635E-25) и эмиссионных фильтров. (Chroma, ET700/75m; выбирается с помощью колеса фильтров; Thorlabs, FW103H) до того, как изображение будет отображено на двух камерах sCMOS (Hamamatsu, C11440-22CU) с двумя ахроматическими линзами f=50 см. Окончательное увеличение ≈100 нм/пиксель.

Путь возбуждения

Путь возбуждения построен на основе оригинальной конструкции LLS ⁷ . Устройство ATOF (AA ​​OPTO-ELECTRONIC, ATFnC-400.650-TN и драйвер MPDS8C) обеспечивает включение-выключение непрерывного лазерного луча (642нм; MPB Communications, 2RU-VFL-P-500-642-B1R или 2RU-VFL- P-2000-642-B1R) и модуляции мощности лазера. Телескоп с эллиптическими линзами изменяет форму возбуждающих лучей, прежде чем они будут пространственно модулированы с помощью комбинации фазового пространственного модулятора света (SLM; Forth Dimension Displays, QXGA-3DM), ахроматической четвертьволновой пластины и поляризационного светоделителя. . Модулированный луч подвергается преобразованию Фурье с помощью линзы, а немодулированный свет блокируется с помощью специальной кольцевой маски (Photo Sciences, индивидуальный дизайн). Полученная двумерная оптическая решетка сглаживается с помощью x -осевой гальванометр (Thorlabs, GVS001), помещенный в плоскость, сопряженную с задней фокальной плоскостью (BFP) возбуждающей линзы. Камеры, сопряженные с образцами и BFP (Thorlabs, DCC1545M и Edmund EO-0312M), используются для проверки двумерной решетки.

Управление прибором и синхронизация

Управление прибором и синхронизация выполняются с помощью пользовательского приложения Lab-VIEW (National Instruments, 2015, 64-разрядная версия) и аппаратной системы реального времени на базе FPGA (National Instruments, PCIe-7852R LX50).

Крепление для образца и ячейка для образца

Для размещения сетки для электронной микроскопии в пространстве между 3 линзами объектива мы изготавливаем зажимной держатель образца из стержня из нержавеющей стали. Держатель образца устанавливается на поворотную опору и кинематический адаптер с регулируемым шагом (Thorlabs, RSP05 и TPA01), которые затем устанавливаются на предметный столик 3D-нанопозиционирования (Physik Instrumente, P-733.3DD с контроллером E-727.3CDA) и . столик перемещения xyz с микрометрическим приводом (Thorlabs, LNR25M). Образец погружают сверху в кубическую камеру, изготовленную из нержавеющей стали (дополнительный рисунок 3).

На трех горизонтальных сторонах камеры есть отверстия для линз обнаружения и возбуждения. Силиконовые листы (толщиной ∼100 мкм) натягиваются на каждую линзу и обеспечивают герметизацию. Четвертая горизонтальная поверхность держателя образца содержит стеклянное окно для наблюдения за внутренней частью камеры.

Визуализация живых клеток

Для визуализации живых клеток температура трех объективов и ячейки с образцом регулируется до ∼37°C с помощью резистивных нагревателей и термисторных датчиков. Отдельный регулятор температуры (Thorlabs, TC200) регулирует температуру каждой линзы объектива, а также нагревательной пластины в основании и крышки в верхней части ячейки для образцов соответственно. Точные заданные значения температуры определяются опытным путем, а температура среды внутри измерительной ячейки проверяется с помощью независимого датчика без контура. Верхняя крышка в дальнейшем используется для подачи смеси N ₂ , газы CO ₂ и O ₂ , расход которых регулируется тремя независимыми регуляторами массового расхода (Omega Engineering).

Подготовка образцов клеток

Подготовка сетки для ЭМ, осаждение шариков и посев клеток

Клетки культивировали на золотых сетках для электронной микроскопии (ЭМ) с пленками Formvar (Ted-Pella, 01703G). Для клеток mESC сетки ЭМ предварительно покрывали 5 мг/мл ламинина (BioLamina LN511) при 37°C в течение ночи во влажном инкубаторе с 5% CO2. Для клеток U-2 OS сетки ЭМ предварительно покрывали коллагеном (Sigma C8919) при 37°C в течение ночи во влажном инкубаторе с 5% CO2. В обоих случаях сетки ЭМ были покрыты пленкой Formvar вверх. После нанесения покрытия ЭМ сетки ненадолго промывали раствором 1×PBS и переворачивали для добавления флуоресцентных реперных точек. Гранулы TetraSpeck размером 0,1 мкм (ThermoFisher Scientific T7279) разбавляли 1:300 1×PBS, и к разбавленным гранулам добавляли MgCl ₂ до конечной концентрации ~0,1 М. Затем разбавленные гранулы наносили на сетки ЭМ на 10 мин при 37°C и удаляли, кратко промывая 1×PBS. Затем ЭМ-сетки переворачивали пленкой Formvar вверх и помещали в микролуночные чашки со стеклянным дном (MatTek, P35G-1,5-14-C), готовые для посева клеток. Клетки обрабатывали трипсином, подсчитывали и приблизительно 0,3 миллиона клеток высевали в соответствующие среды.

Клеточная культура и окрашивание

Все клеточные культуры выдерживали при 37°C в атмосфере 5% об./об. CO2 во влажном инкубаторе. Клетки Brd4 OMG культивировали в среде +2i с 400 мкг/мл G418 (Sigma G8168-10ML) на чашках, покрытых 0,1% желатином, при 37°C во влажном инкубаторе с 5% CO2. Среда +2i содержит D-MEM (Thermo Fisher Scientific 10313021), 15% фетальной бычьей сыворотки (Gemini Bio 100-500), 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола (Thermo Fisher Scientific 21985023), 2 мМ L-аланил-L-глутамина (Thermo Fisher Scientific 21985023). Фишер Сайентифик 35050079), 1× заменимых аминокислот MEM (Thermo Fisher Scientific 11140076), 1000 ед/мл LIF (Millipore ESG1107), 3 мкм CHIR99021 (Millipore 361559) и 1 мкм PD0325901 (Axon Medchem 1408). Перед визуализацией клетки засевали средой -2i плюс 400 мкг/мл G418. Для окрашивания SiR клетки метили 0,3 мкМ SiR-BG в течение 10 мин при 37°C с последующей трехкратной промывкой новой средой.

Клетки клона 5 CMV поддерживали в среде McCoy’s 5A без фенолового красного (GE Healthcare Sh40200.01), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gemini Bio, 100-500), 1× раствор заменимых аминокислот (Thermo Fisher Scientific 11140050), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fisher Scientific 11360070), 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, 15140122) плюс 1 мкг/мл α-аманитина (Sigma A2232) и 1 мкг/мл пуромицина (Sigma P8833). Клетки клона 5 CMV нуклеофицировали 0,2 мкг tdPCP-Halo и 0,5 мкг плазмид TetR-RFP (Amaxa kit VCA-1003, Lonza) и засевали средой, содержащей α-аманитин и пуромицин. Через 1-3 дня после нуклеофекции клетки окрашивали лигандом JF646-SNAP-tag (JF646-BG) и использовали для экспериментов по визуализации. Для окрашивания клетки инкубировали со средой, содержащей 1 мкМ JF646-BG, в течение 1 часа, один раз промывали новой средой и заменяли новой средой, содержащей лекарства.

Фиксация клеток

Клетки фиксировали свежеприготовленным 4% об./об. формальдегидом, не содержащим метанола (Thermo Scientific 28906), в 1×PBS при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем промывали 3 раза 1×PBS. После фиксации образцы хранили при 4°С.

Образец для выравнивания/калибровки шариков

Для рутинного выравнивания и калибровки прибора мы используем смесь 40-нм сфер (Thermo Fisher Scientific, TransFluoSpheres 488/645, T10711), а также 0,1-мкм шарики Tetraspek, нанесенные на золотые ЭМ сетки с Пленки формвар. Шарики размером 0,1 мкм обеспечивают более высокий уровень сигнала и могут облегчить быстрое отображение профиля возбуждения LLS, а сферы размером 40 нм используются для точной настройки юстировки интерферометра.

Сбор и анализ данных

3D-iLLS и обычная визуализация LLS выполняются путем сканирования образца через стационарную схему возбуждения LLS. Мы сканируем образец одновременно в yz вдоль оси ~ 35 ° относительно направления распространения LLS (дополнительный рисунок 3 c ). Размер шага z составляет 20 нм. Трехмерное отслеживание частиц с использованием модуляционной интерферометрии выполняется путем удержания образца в стационарном состоянии и пошагового изменения пьезоэлектрического фазовращателя с шагом, соответствующим относительным фазовым изменениям на 90° или 60°, для 4-ступенчатого и 6-ступенчатого циклов модуляции соответственно. Для излучения дальней красной флуоресценции размер шага составляет 182,5 нм и 121,67 нм соответственно, поскольку один период модуляции соответствует перемещению фазовращателя на ≈730 нм. Необработанные данные изображения сохраняются в двоичном формате и импортируются для обработки в MATLAB (Mathworks, 2014b).

Объемная реконструкция 3D-iLLS

Необработанные данные 3D-iLLS и обычные данные LLS были выровнены и подвергнуты деконволюции в MATLAB с использованием измеренной PSF. Деконволюция была применена к изображениям на рисунках 2 9.0082 a,b , но не к рис. 2 с, д . Объемные данные были импортированы в ImageJ для визуализации и расчетов максимальной проекции.

Отслеживание частиц 3D-iLLS с использованием интерферометрии модуляции

Необработанные изображения были импортированы в ImageJ, и кадры из каждого цикла модуляции были сгруппированы вместе в одном изображении с максимальной проекцией. Изображения максимальной проекции были импортированы в MATLAB для двумерного анализа отслеживания частиц ²⁰ . Траектории выбранных частиц были дополнительно уточнены путем выполнения 2D-аппроксимации по Гауссу в ROI 11×11 пикселей для получения более точных xy координаты. Для получения координаты z мы сначала суммируем интенсивность пикселей в области интереса размером 7×7 пикселей с центром в координате xy частицы. Чтобы объединить интенсивности, измеренные от Cam0 и Cam1, интенсивность Cam1 масштабируется до того же среднего значения и стандартного отклонения, что и Cam0. Наконец, мы вычисляем фазу модуляции интенсивности в каждом цикле, чтобы извлечь позицию z . На каждом этапе фаза модуляции извлекается в интервале 2π с центром в предыдущей фазе. Заметим, что для смещений частиц в последовательных циклах, малых по сравнению с половиной интерферометрического периода (≈265 нм/2 = 132,5 нм), эта процедура также позволяет разворачивать и отслеживать фазу по нескольким интерферометрическим полосам.

Вклад автора

A.P. задумал, спроектировал и руководил исследованием. А.П. и Б.К. построил экспериментальный аппарат. ДО Н.Э. разработали программное обеспечение для сбора данных, написали код для анализа и проверили оптические характеристики установки 3D-iLLS. Г.В. провел численные расчеты. JL приготовил образцы клеток. А.П. провел эксперименты, проанализировал и интерпретировал данные и написал рукопись.

Конкурирующие интересы

MSKCC подала заявку на патент на системы и методы модуляционной интерферометрической визуализации.

Доступность данных

Данные, подтверждающие выводы статьи, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Доступность кода

Пользовательский код можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу. Программное обеспечение для сбора данных и управления прибором можно запросить для академического использования у соответствующего автора после заключения соглашений о передаче материалов с MSKCC.

Благодарности

Мы благодарим Грегори Айзенберга (MSKCC Medical Physics) за профессиональную обработку, Даниэля Мазовера за помощь в CAD и Люка Лависа за реагенты для окрашивания. Эта работа была поддержана премией NYSTEM за постдокторское обучение (C32599GG; JL), грантом Национального института рака (P30 CA008748) и премией директора Национального института здравоохранения (NIH) для новых новаторов (1DP2GM105443-01; AP). В. Герстнер-младший, Фонд молодых исследователей (AP).

Каталожные номера

1. 1.↵

   Хелл, С. и Стельцер, Э.Х.К. Свойства конфокального флуоресцентного микроскопа 4pi. J Opt Soc Am A 9, 2159–2166 (1992).

2. 2.↵

   Густафссон М.Г.Л., Агард Д.А. и Седат, Дж.В. Семикратное улучшение осевого разрешения в 3D широкопольной микроскопии с использованием двух объективов. P Soc Photo-Opt Ins 2412, 147–156 (1995).

3. 3.↵

   Ван, Г., Хаувер, Дж., Томас, З., Дарст, С.А. и Перцинидис, А. Одномолекулярная трехмерная визуализация цикла транскрипции в реальном времени с помощью модуляционной интерферометрии. Cell 167, 1839–1852 e1821 (2016).

4. 4.↵

   Густафссон М.Г., Агард Д.А. и Седат, Дж.В. I5M: трехмерная широкопольная световая микроскопия с осевым разрешением лучше 100 нм. J Microsc 195, 10–16 (1999).

5. 5.

   Штенгель Г. и др. Интерферометрическая флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения разрешает трехмерную клеточную ультраструктуру. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 3125–3130 (2009).

6. 6.↵

   Акино, Д. и др. Двухцветная наноскопия трехмерных объемов путем обнаружения 4Pi стохастически переключаемых флуорофоров. Nat Methods 8, 353–359 (2011).

7. 7.↵

   Чен, Британская Колумбия и другие. Решетчатая световая микроскопия: визуализация молекул эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением. Наука 346, 1257998 (2014).

8. 8.↵

   Gao, L. et al. Неинвазивная визуализация за пределами дифракционного предела трехмерной динамики в сильно флуоресцентных образцах. Cell 151, 1370–1385 (2012).

9. 9.↵

   Gebhardt, J.C. et al. Одномолекулярная визуализация фактора транскрипции, связывающегося с ДНК в живых клетках млекопитающих. Nat Methods 10, 421–426 (2013).

10. 10.↵

    Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. & Stelzer, E.H. Оптические срезы глубоко внутри живых эмбрионов с помощью микроскопии с селективным плоским освещением. Наука 305, 1007–1009 (2004).

11. 11.↵

    Планшон Т.А. и другие. Быстрое трехмерное изотропное изображение живых клеток с использованием плоскостного освещения луча Бесселя. Nat Methods 8, 417–423 (2011).

12. 12.↵

    Vettenburg, T. et al. Световая микроскопия с использованием пучка Эйри. Nat Methods 11, 541–544 (2014).

13. 13.↵

    Li, J. et al. Одномолекулярная наноскопия выявляет транскрипцию РНК-полимеразы II в отдельных генах в живых клетках. Cell 178, 491–506 e428 (2019).

14. 14.↵

    Legant, W.R. et al. Трехмерная локализационная микроскопия высокой плотности в больших объемах. Nat Methods 13, 359–365 (2016).

15. 15.↵

    Liu, Z. et al. Трехмерное изображение кластеров энхансеров Sox2 в эмбриональных стволовых клетках. elife 3, e04236 (2014).

16. 16.↵

    Лю, Т.Л. и другие. Наблюдение за клеткой в ​​ее естественном состоянии: визуализация субклеточной динамики многоклеточных организмов. Наука 360 (2018).

17. 17.↵

    Нагорни, М. и Хелл, С.В. Согласованное использование противоположных линз для увеличения осевого разрешения. II. Мощность и ограничения нелинейного восстановления изображений. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis 18, 49–54 (2001).

18. 18.↵

    Pertsinidis, A. & Wang, G. WO2018106678A1

19. 19.↵

    M.G.s, Gustaf, Gustaf, и другие. Удвоение трехмерного разрешения в широкопольной флуоресцентной микроскопии за счет структурированного освещения. Biophys J 94, 4957–4970 (2008).

20. 20.↵

    Crocker, J.C. & Grier, D.G. Методы цифровой видеомикроскопии для коллоидных исследований. J Colloid Interf Sci 179, 298–310 (1996).

Наверх

Lamb Weston Private Reserve Lattice Chips с кожей на простом рецепте | Ягненок Вестон®

Артикул №: h4031

Марка: LW Private Reserve

^®

Размер нарезки: решетчатая стружка

Размер упаковки: 5/5#

Lamb Weston ^® Картофельные предложения Private Reserve отличаются аутентичным кухонным вкусом и исключительным вкусом. Эти хрустящие, высококлассные чипсы быстрого приготовления в уникальной решетчатой ​​нарезке обеспечивают неповторимый вкус и текстуру. Подается горячим или холодным, этот чипс можно приготовить заранее, чтобы сэкономить время и силы в часы пик, и он легко наполняет тарелки и корзины.

Привлекательный кухонный гарнитур | Большее покрытие плиты | Экономия времени и труда

Запросить образец

Посмотреть спецификацию

• Преимущества оператора

• Питание и методы приготовления

• Доставка и хранение

Создан с подлинной кулинарной привлекательностью и исключительным вкусом.

Высококачественный картофель фри премиум-класса наполняет тарелку меньшим количеством полосок, чем бюджетный картофель фри.

Экономьте время и трудозатраты, заменив нарезку, очистку и подготовку в домашних условиях готовым решением прямо из морозильной камеры.

Питание

Размер порции 3 унции (84 г/около 13 штук)

Порции в контейнере Около 130

Калории [на порцию] 150

Количество на порцию		% Дневная стоимость*
Общий жир	8 г	10%
Насыщенные жиры	0,5 г	3%
Трансжиры	0 г
Холестерин	0 мг	0%
Натрий	280 мг	12%
Всего углеводов	18 г
Пищевые волокна	2 г	7%
Всего сахаров	менее 1 г
Добавленный сахар	0 г	0%
Белок	2 г
Витамин D	0 мкг	0%
Кальций	11 мг	0%
Железо	0,41 мг	2%
Калий	310 мг	6%

* % дневной нормы (DV) показывает, сколько питательных веществ в порции пищи способствует ежедневному рациону. 2000 калорий в день используются для общих рекомендаций по питанию.

Ингредиенты

Ингредиенты: Картофель, рапсовое масло, отжатое экспеллером, морская соль.

Оценка отлично

Кошерный: Нет

Халяль: Да

Фритюрница

Время	2 — 2 1/2 мин
Температура	345–350°F
Дополнительные инструкции	Фритюр из замороженного состояния. Заполняйте корзину на 1/2 для оптимального качества продуктов. Часто встряхивайте корзину во время жарки. Поместите прижимную корзину на чипсы в течение последних минут жарки. Не переварите.

Информация о доставке и хранении

Артикул	х4031
GTIN	10044979221490
Вес нетто	25 фунтов
Вес брутто	28 фунтов
Количество на фунт	Н/Д
Кейс-куб	1,64
Ти/Привет	6,9
Страна происхождения	США
Срок годности	720 дней

Инструкции по обращению

Не ронять. Обращайтесь как с яйцами. Скоропортящийся, хранить в замороженном виде. Хранить при температуре 0°F или ниже.

Посмотреть похожие продукты

Lamb Weston ^® Чипсы Yukon Private Reserve Skin-On

Lamb Weston ^® Чипсы Private Reserve Skin-On

Рецепт корочки для решетчатого пирога — ZoëBakes

23 июня 2008 г. (обновлено 18 января 2022 г.) Зои Франсуа | базовый, пирог, рецепт, ZoëBakes Academy

Из очень небольшого количества ингредиентов можно приготовить один из самых любимых американских десертов — пирог. Начнем с коржа, каркаса, на котором находится начинка, в данном случае из белого персика и малины. Он должен быть нежным и слоеным, маслянистым и прекрасным дополнением ко всему, что вы положили внутрь. Я вечно ищу то, что считаю идеальной корочкой для пирога. Рецептов столько, сколько домохозяйств. У каждой семьи, кажется, есть свой собственный ценный рецепт. Если вам трудно воссоздать корочку вашей бабушки, это может быть не вина рецепта, а техника, которую вы используете. Попробуйте следовать моим инструкциям о том, как сделать это тесто с решетчатым коржом для пирога. Я взял рецепт из последнего тома 9 Дори Гринспен.0034 Выпечка: Из моего дома в ваш .

Идеальное тесто для пирогов 101 для теста для решетчатого пирога

Все оборудование, которое я использую здесь.

У вас есть вопросы по пирогам или вам нужно устранить неполадки в рецепте? Посмотрите мое руководство о том, как приготовить корж для пирога.

Подсказка перед началом работы все должно быть как можно холоднее . В очень жаркий летний день я даже замораживаю муку перед тем, как начать, чтобы она не растопила масло, когда я замешиваю. В любой момент процесса, если ваше масло кажется слишком мягким, просто бросьте все это в морозильную камеру на несколько минут.

Рецепт в нижней части этого поста: «Подходит практически для любого теста для пирогов» из Выпечка: от моего дома к вашему Дори Гринспен. Вы можете увидеть, как я делаю это тесто шаг за шагом ниже.

Оборудование для приготовления теста для пирогов

Кухонный комбайн Cuisinart 7-Cup

Мраморная скалка

Колесо для выпечки

Используется для обрезки решетчатых полос

Кисть для кондитерских изделий

Как приготовить идеальное тесто для решетчатого пирога

Следующие указания принадлежат мне, и Дори может со мной согласиться, а может и не согласиться!

Есть много способов измельчить масло и жир в муку, но я предпочитаю использовать Cuisinart и руки. Cuisinart быстро расщепляет жир, поэтому у него меньше времени для разогрева.

Положите масло в машину на 3 части и взбейте 2-3 раза. К тому времени, когда вы добавите все масло, часть его полностью смешается с мукой, а часть превратится в крупные кусочки размером с горошину.

Добавляйте ледяную воду в тесто по 3 столовые ложки за раз и взбивайте один раз, чтобы перемешать. Если вы будете слишком сильно пульсировать в этот момент, вы продолжите слишком сильно расщеплять масло.

Когда вы добавите всю воду, вылейте тесто на стол или в большую плоскую миску. Возможно, все еще потребуется немного воды, поэтому я предпочитаю делать все остальное вручную, чтобы не слишком сильно разбить масло.

Сначала попробуйте сжать тесто, чтобы определить, не слишком ли оно сухое. Если он не держится или все еще остается порошкообразная мука, добавьте еще пару столовых ложек воды и попробуйте снова спрессовать.

Тесто должно собираться, не разваливаться, но не быть слишком кашеобразным от воды.

Спрессуйте бревно и разрежьте на 2 части.

Сформируйте из теста диски и хорошо оберните полиэтиленом. Видите целые кусочки масла в тесте, это то, что вам нужно для создания слоености. Охладите не менее 2 часов.

Когда тесто остынет, посыпьте стол мукой.

Раскатайте тесто из центра, добавив немного муки и повернув тесто на 1/4 оборота, чтобы убедиться, что оно не слишком сильно прилипает к поверхности. Если вы используете рулет или винил, вы в конечном итоге будете использовать меньше муки.

Убедитесь, что тесто подходит для формы, которую вы используете. Вокруг тарелки для пирога должно быть около 2 дополнительных дюймов.

С помощью скалки перенесите тесто на форму для пирога. Поместите скалку в середину теста и сверните тесто над булавкой, чтобы поднять его.

Поместите тесто в форму для пирога, не нажимайте и не растягивайте его, иначе оно сожмется по бокам во время выпекания. Поместите форму для пирога с тестом в холодильник, чтобы отдохнуть, пока вы делаете решетку.

Раскатайте следующий диск из теста так же, как и первый, но на этот раз вам нужно сделать его на листе винила или на валике, чтобы его можно было поднять. Теперь вы будете использовать колесо для выпечки, чтобы нарезать полоски в тесте. В зависимости от вашей индивидуальности вы можете измерить полоски или увидеть их на глаз. Когда вы закончите нарезать полоски, удалите каждую вторую и отложите в сторону.

Согните каждую вторую из оставшихся полос к средней точке. Положите одну из частей, которые вы отложили, поверх полосок, которые лежат ровно. Разверните полоски и повторите со следующим набором.

Продолжайте, пока не дойдете до конца этой стороны, а затем начните с другой стороны.

После того, как решетка будет готова, переместите винил или рулет на разделочную доску или противень, чтобы их можно было легко перенести в холодильник. Нужно дать этому остыть, чтобы легче было сползать на наполненный пирог.

Когда решетка остынет, она легко наденется на форму для пирога с фруктами. Затем вам нужно будет обрезать лишнюю длину решетчатых полос.

Они должны располагаться прямо над начинкой.

Загните стороны формы для пирога и затем обогните их любым выбранным вами способом.

Смажьте поверхность корочки решетчатого пирога, но не края оболочки, яичной смесью.

Посыпать сахаром, затем я помещаю пирог в морозильную камеру примерно на 15 минут, пока духовка разогревается до 425. Замораживание теста поможет ему застыть, чтобы оно не сдуло ваш дизайн, когда будет входить в духовку. печь. Через 30 минут уменьшите температуру до 375 ° F и запекайте, пока фрукты не начнут пузыриться, а сок не станет прозрачным. Время выпекания пирога зависит от начинки. Мой персиково-малиновый пирог занял около часа. Возможно, вам придется свернуть корж, если он подрумянится слишком быстро, когда начинка полностью пропечется.

Идеальная корочка для пирога

Прежде чем вы начнете, все должно быть как можно более холодным. В очень жаркий летний день я даже замораживаю муку перед тем, как начать, чтобы она не растопила масло, когда я замешиваю. В любой момент процесса, если ваше масло кажется слишком мягким, просто бросьте все это в морозильную камеру на несколько минут.

4.84 от 6 голосов

Курс: Десерт

Автор: Из книги Дори Гринспен «Выпечка: из моего дома в твою»

За 9Двойная корочка

• 3 чашки универсальной муки, которую можно заменить 1/2 чашки цельнозерновой мукой
• 1/4 чашки сахара
• 1 1/2 чайной ложки соли
• 2 1/2 палочки (10 унций) очень холодное (хорошо замороженное) несоленое сливочное масло, нарезанное на кусочки размером со столовую ложку
• 1/3 стакана замороженного растительного жира, нарезанного на кусочки размером со столовую ложку
• ~1/2 стакана ледяной воды, на всякий случай приготовьте еще
• яичная смесь 1 яйцо, смешанное с 1 столовой ложкой воды
• сахар для посыпки

• Смешайте муку, сахар и соль. Есть много способов измельчить масло и шортенинг в муку, но я предпочитаю использовать комбинацию кухонного комбайна и рук. Кухонный комбайн быстро расщепляет жир, поэтому у него меньше времени на разогрев. Положите масло в машину на 3 части и взбейте 2-3 раза. К тому времени, когда вы добавите все масло, часть его полностью смешается с мукой, а часть превратится в крупные кусочки размером с горошину. Добавьте замороженный шортенинг и взбивайте, пока он тоже не станет кусочками размером с горошину (он намного мягче, поэтому быстро распадается). Добавляйте ледяную воду в тесто по 3 столовые ложки за раз и взбивайте один раз, чтобы смешать. Если вы будете слишком сильно пульсировать в этот момент, вы продолжите слишком сильно расщеплять масло.

• После того, как вы добавили всю воду, вылейте тесто на стол или в большую плоскую миску (хорошо подойдет миска для пасты). Еще может понадобиться немного воды, поэтому я предпочитаю делать все остальное вручную, чтобы не слишком сильно расщеплять масло.

• Сначала попробуйте сжать тесто, чтобы определить, не слишком ли оно сухое. Если он не держится или все еще остается порошкообразная мука, равномерно побрызгайте еще парой столовых ложек воды на сухие места и попробуйте снова прижать. Сложите тесто несколько раз с помощью скребка. Тесто должно собираться, не разваливаться, но и не быть слишком кашеобразным от воды.

• Спрессуйте в бревно и разрежьте на 2 части. Сформируйте из теста два диска и оберните их полиэтиленом. Охладить не менее 1 часа, но это можно сделать накануне или положить в морозилку на пару недель (разморозить на ночь в холодильнике, а не на столе, иначе он будет слишком мягким).

• Когда тесто остынет, посыпьте мукой силиконовый коврик. Раскатайте тесто из центра, добавив немного муки и повернув тесто на 1/4 оборота, чтобы убедиться, что оно не слишком прилипает к поверхности. Если вы используете силиконовый коврик, вы будете использовать меньше муки.

• Убедитесь, что тесто подходит для формы, которую вы используете. Вокруг тарелки для пирога должно быть около 2 дополнительных дюймов. С помощью скалки перенесите тесто на форму для пирога. Поместите скалку в середину теста и сверните тесто над булавкой, чтобы поднять его.

• Поместите тесто в форму для пирога, не нажимайте и не растягивайте его, иначе во время выпекания оно сожмется по бокам. Поместите форму для пирога с тестом в холодильник, чтобы отдохнуть, пока вы делаете решетку.

• Раскатайте следующий диск теста так же, как и первый, но на этот раз вам нужно сделать его на листе винила или силиконовом коврике, чтобы его можно было поднять. Теперь вы будете использовать колесо для выпечки, чтобы нарезать полоски в тесте. В зависимости от вашей индивидуальности вы можете измерить полоски или увидеть их на глаз. Когда вы закончите нарезать полоски, удалите каждую вторую и отложите в сторону.

• Каждую вторую из оставшихся полос сложите к средней точке. Положите одну из частей, которые вы отложили, поверх полосок, которые лежат ровно. Разверните полоски и повторите со следующим набором. Продолжайте, пока не дойдете до конца этой стороны, а затем начните с другой стороны.

• После того, как решетка будет готова, положите виниловый или силиконовый коврик на разделочную доску или противень, чтобы можно было легко перенести его в холодильник. Нужно дать этому остыть, чтобы легче было сползать на наполненный пирог.

• Когда решетка остынет, она легко наденется на форму для пирога с фруктами. Затем вам нужно будет обрезать лишнюю длину решетчатых полос. Они должны располагаться прямо над начинкой. Сложите стороны пирога, а затем обогните их любым узором, который вы выберете.

• Смажьте поверхность решетки, но не края формы для пирога, яичной смесью. Посыпать сахаром, затем я помещаю пирог в морозильную камеру примерно на 15 минут, пока духовка разогревается до 425 F. Замораживание теста поможет застыть, чтобы оно не испортило ваш рисунок, когда будет помещено в духовку. .

  No related posts.