По длине: выбор слов — Как правильно: по длине, в длину или длиной?

Доступность кода

Программы и рабочие процессы kallisto-ls, StringTie-ls и Trinity-ls доступны по адресу:

• https://github.com/canzarlab/ladderseq_quant,

• https://github.com /canzarlab/ladderseq_assembly и

• https://github.com/canzarlab/ladderseq_denovo,

соответственно. Результаты наших эталонных исследований можно воспроизвести с помощью файла Snakefile 9.0987 33 , доступно по адресу https://github.com/canzarlab/ladderseq_benchmark.

Ссылки

1. Чжан, К., Чжан, Б., Линь, Л.-Л. & Zhao, S. Оценка и сравнение вычислительных инструментов для количественного определения изоформ РНК-seq. BMC Genomics 18 , 583 (2017).

   ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

2. Тэн, М. и др. Эталон для конвейеров количественной оценки RNA-seq. Геном Биол. 17 , 74 (2016).

   ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

3. Aguiar, D. et al. Байесовское непараметрическое обнаружение изоформ и индивидуальный количественный анализ. Нац. коммун. 9 , 1681 (2018).

   ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

4. Сонг, Л., Сабунчиян, С., Янг, Г. и Флореа, Л. Подход с несколькими образцами повышает точность сборки стенограммы. нац. коммун. 10 , 5000 (2019).

   ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

5. Li, W. V. et al. AIDE: обнаружение изоформ с помощью аннотаций с высокой точностью. Рез. генома. 29 , 2056–2072 (2019).

6. Desrosiers, R.C., Friderici, K.H. & Rottman, FM. Характеристика метилирования мРНК гепатомы Новикофф и гетерогенности метилированного 5′-конца. Биохимия 14 , 4367–4374 (1975).

   КАС пабмед Google ученый

7. Barbosa-Morais, N.L. et al. Эволюционный ландшафт альтернативного сплайсинга у позвоночных. Наука 338 , 1587–1593 (2012).

   КАС пабмед Google ученый

8. Елен, Н., Уле, Дж., Живин, М. и Дарнелл, Р. Б. Эволюция nova-зависимой регуляции сплайсинга в головном мозге. PLoS Genetics 3 , e173 (2007).

   Центральный пабмед Google ученый

9. Меркин Дж., Рассел К., Чен П. и Бердж С. Б. Эволюционная динамика регуляции генов и изоформ в тканях млекопитающих. Наука 338 , 1593–1599 (2012).

   КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

10. Tardaguila, M. et al. SQANTI: обширная характеристика последовательностей длинных транскриптов для контроля качества при идентификации и количественном определении полноразмерного транскриптома. геном рез. 28 , 396–411 (2018).

    КАС ПабМед Центральный Google ученый

11. Чен, К. и др. Полногеномное связывание и механистический анализ Smchd1-опосредованной эпигенетической регуляции. проц. Натл акад. науч. США 112 , E3535–E3544 (2015 г. ).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

12. Soneson, C. et al. Всестороннее исследование секвенирования нативной РНК Nanopore для характеристики сложных транскриптомов. нац. коммун. 10 , 3359 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

13. Hurowitz, E.H. & Brown, P.O. Полногеномный анализ длин мРНК у Saccharomyces cerevisiae . Геном Биол. 5 , R2 (2003).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

14. Брей, Н. Л., Пиментел, Х., Мелстед, П. и Пачтер, Л. Почти оптимальная вероятностная количественная оценка секвенирования РНК. нац. Биотехнолог. 34 , 525 (2016).

    КАС пабмед Google ученый

15. «>

    Хебер, С., Алексеев, М., Сзе, С.-Х., Танг, Х. и Певзнер, П. А. Графы сплайсинга и проблема сборки EST. Биоинформатика 18 , S181–S188 (2002).

    ПабМед Google ученый

16. Pachter, L. Модели для количественного определения транскриптов из РНК-seq. Препринт на https://arxiv.org/abs/1104.3889(2011).

17. Ковака С. и др. Сборка транскриптома из долгосрочных выравниваний РНК-seq с Stringtie2. Геном Биол. 20 , 278 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

18. Эбрахим Сахраян, С. М. и др. Получение всестороннего биологического понимания транскриптома путем выполнения анализа секвенирования РНК широкого спектра. Нац. коммун. 8 , 59 (2017).

19. Глинос, Д. А. и др. Изменение транскриптома в тканях человека, выявленное с помощью секвенирования с длительным чтением. Препринт на https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.01.22.427687v1 (2021).

20. Grabherr, M.G. et al. Сборка полноразмерного транскриптома из данных секвенирования РНК без эталонного генома. Нац. Биотехнолог . 29 , 644–652 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

21. Чанг З., Ван З. и Ли Г. Влияние длины чтения и сложности транскриптома на сборку de novo: имитационное исследование. PLoS ONE 9 , 1–8 (2014).

    Google ученый

22. Донг, X. и др. Длинные и короткие: разблокировка данных секвенирования РНК с длинным считыванием нанопор с помощью инструментов анализа дифференциальной экспрессии с коротким считыванием. НАР Геном. Биоинформ. 3 , lqab028 (2021).

23. Wang, Y. et al. N ⁶ -метиладенозин Модификация РНК регулирует самообновление эмбриональных нейральных стволовых клеток посредством модификаций гистонов. Нац. Неврологи. 21 , 195–206 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

24. Канзар, С., Андреотти, С., Виз, Д., Райнерт, К. и Клау, Г. В. ЦИДАН: всестороннее обнаружение изоформ и оценка распространенности. Геном Биол. 17 , 16 (2016).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

25. Алкасем И., Сонталия Ю., Клитцке-Фезер Э., Шим Х. и Канзар С. Максплайсер: вероятностная модель для оценки использования сайта сплайсинга на основе данных секвенирования РНК. Биоинформатика 37 , 2004–2011 (2021).

    КАС ПабМед Центральный Google ученый

26. Batista, P. J. et al. m ⁶ a Модификация РНК контролирует смену клеточных судеб в эмбриональных стволовых клетках млекопитающих. Cell Stem Cell 15 , 707–719 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

27. Ке, С. и др. Большинство остатков m ⁶ a находятся в последних экзонах, что делает возможной регуляцию 3′-UTR. Гены Дев. 29 , 2037–2053 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

28. Yamauchi, T., Nishiyama, M., Moroishi, T., Kawamura, A. & Nakayama, K. I. Инактивация FBXL5 в мозге мыши вызывает аберрантную пролиферацию нервных стволовых клеток-предшественников. мол. Клетка. биол. 37 , e00470-16 (2017).

29. Kuboyama, K., Fujikawa, A., Suzuki, R. & Noda, M. Инактивация рецептора протеинтирозинфосфатазы типа Z плейотрофином способствует ремиелинизации посредством активации дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов. Дж. Неврологи. 35 , 12162–12171 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

30. Kurosaki, T., Popp, M.W. & Maquat, L.E. Контроль качества и количества экспрессии генов с помощью нонсенс-опосредованного распада мРНК. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 20 , 406–420 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

31. Lianoglou, S., Garg, V., Yang, J.L., Leslie, C.S. & Mayr, C. Повсеместно транскрибируемые гены используют альтернативное полиаденилирование для достижения тканеспецифической экспрессии. Гены Дев. 27 , 2380–2396 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

32. Тан, А. Д. и др. Полноразмерная характеристика транскрипта мутации SF3B1 при хроническом лимфоцитарном лейкозе выявляет подавление сохраненных интронов. нац. коммун. 11 , 1438 (2020).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

33. Кестер, Дж. и Рахманн, С. Snakemake — масштабируемая система биоинформатического рабочего процесса. Биоинформатика 28 , 2520–2522 (2012).

    ПабМед Google ученый

34. ДеАнгелис, М. М., Ван, Д. Г. и Хокинс, Т. Л. Твердофазная обратимая иммобилизация для выделения продуктов ПЦР. Рез. нуклеиновых кислот. 23 , 4742–4743 (1995).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

35. Собчак К. и Кржизосяк В. Дж. Анализ структуры РНК с помощью капиллярного электрофореза. Рез. нуклеиновых кислот. 30 , е124 (2002).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

36. «>

    Азарани, А. и Хекер, К. Х. Анализ РНК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой ионов. Рез. нуклеиновых кислот. 29 , e7 (2001).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

37. Wang, Y. et al. Профиль транскриптомов с высоким разрешением показывает роль альтернативного сплайсинга в модулировании реакции кукурузы на азот. BMC Genomics 21 , 353 (2020).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

38. Ли, Р. и др. Прямое полноразмерное секвенирование РНК выявило неожиданную сложность транскриптома во время развития Caenorhabditis elegans . Рез. генома. 30 , 287–298 (2020).

39. Haussmann, I.U. et al. m ⁶ a потенцирует альтернативный сплайсинг пре-мРНК Sxl для надежного определения пола Drosophila . Природа 540 , 301–304 (2016).

    КАС пабмед Google ученый

40. Бартосович, М. и др. N ⁶ -метиладенозиндеметилаза FTO нацелена на пре-мРНК и регулирует альтернативный сплайсинг и процессинг 3′-конца. Рез. нуклеиновых кислот. 45 , 11356–11370 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

41. Xiao, W. et al. Nuclear m ⁶ a ридер YTHDC1 регулирует сплайсинг мРНК. мол. Сотовый 61 , 507–519(2016).

    КАС пабмед Google ученый

42. Zhou, K.I. et al. Регуляция ко-транскрипционного сплайсинга пре-мРНК m ⁶ a через белок низкой сложности hnRNPG. мол. Сотовый 76 , 70–81 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

43. «>

    Jacob, A.G. & Smith, C.W.J. Сохранение интронов как компонент регулируемых программ экспрессии генов. гул. Жене. 136 , 1043–1057 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

44. Брауншвейг, У. и др. Широко распространенное удержание интронов у млекопитающих функционально настраивает транскриптомы. Рез. генома. 24 , 1774–1786 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

45. Юн, К.-Дж. и другие. Временной контроль нейрогенеза коры головного мозга млекопитающих с помощью m ⁶ метилирование. Сотовый 171 , 877–889 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

46. Экманн, С. Р., Раммельт, К. и Вале, Э. Контроль длины хвоста поли(А). Wiley Interdiscip. Rev. RNA 2 , 348–361 (2011).

    КАС пабмед Google ученый

47. Добин А. и др. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика 29 , 15–21 (2013).

    КАС пабмед Google ученый

48. Конфорти, Л. и др. Изоформа Kif1Bβ обогащена моторными нейронами, но не изменяется в мышиной модели бокового амиотрофического склероза. J. Neurosci. Рез. 71 , 732–739 (2003).

    КАС пабмед Google ученый

49. Jiang, L. et al. Синтетические вводные стандарты для экспериментов с секвенированием РНК. геном рез. 21 , 1543–1551 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

50. «>

    Li, B. & Dewey, C. N. RSEM: точный количественный анализ транскриптов по данным секвенирования РНК с эталонным геномом или без него. Биоинформатика BMC 12 , 323 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

51. Лаппалайнен, Т. и др. Секвенирование транскриптома и генома раскрывает функциональные различия у людей. Природа 501 , 506–511 (2013).

    Центральный пабмед Google ученый

52. Чанг З. и др. Bridger: новая структура для сборки транскриптома de novo с использованием данных секвенирования РНК. Геном Биол. 16 , 30 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

53. Pertea, M. et al. StringTie обеспечивает улучшенную реконструкцию транскриптома из чтений РНК-seq. Нац. Биотехнолог. 33 , 290–295 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

54. Шао, М. и Кингсфорд, К. Точная сборка расшифровок с помощью декомпозиции графа с сохранением фазы. Нац. Биотехнолог. 35 , 1167–1169 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

55. Пертеа, М., Ким, Д., Пертеа, Г. М., Лик, Дж. Т. и Зальцберг, С. Л. Анализ экспрессии на уровне транскрипта в экспериментах по секвенированию РНК с помощью HISAT, StringTie и Ballgown. Нац. Протоколы 11 , 1650 (2016).

    КАС пабмед Google ученый

56. Кент, В. Дж. BLAT — инструмент выравнивания, похожий на BLAST. геном рез. 12 , 656–664 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

57. «>

    Xie, Y. et al. SOAPdenovo-Trans: сборка транскриптома de novo с короткими считываниями RNA-Seq. Биоинформатика 30 , 1660–1666 (2014).

    КАС пабмед Google ученый

58. Liu, J., Yu, T., Mu, Z. & Li, G. TransLiG: сборщик транскриптома de novo, который использует итерацию линейного графа. Геном Биол. 20 , 81 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

59. Робертс, А. и Пачтер, Л. Назначение потокового фрагмента для анализа в реальном времени экспериментов по секвенированию. Нац. Методы 10 , 71–73 (2013).

    КАС пабмед Google ученый

60. Ли, Б., Руотти, В., Стюарт, Р. М., Томсон, Дж. А. и Дьюи, К. Н. Оценка экспрессии генов RNA-Seq с неопределенностью картирования чтения. Биоинформатика 26 , 493–500 (2009).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

61. Виттинг-Сируп, К. и Санделин, А. Ландшафт переключений изоформ при раке человека. мол. Рак Рез. 15 , 1206–1220 (2017).

    КАС пабмед Google ученый

62. Андерс, С., Рейес, А. и Хубер, В. Обнаружение дифференциального использования экзонов по данным секвенирования РНК. геном рез. 22 , 2008–2017 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

63. Park, H. J. et al. CPAT: инструмент оценки кодирующего потенциала с использованием модели логистической регрессии без выравнивания. Рез. нуклеиновых кислот. 41 , е74 (2013).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

64. «>

    Финн, Р. Д. и др. Pfam: база данных семейств белков. Рез. нуклеиновых кислот . 42 , Д222–Д230 (2014).

65. Zhang, Y. et al. Модельный анализ ChIP-Seq (MACS). Геном Биол. 9 , 1–9 (2008).

    Google ученый

66. Куинлан, А. Р. и Холл, И. М. BEDTools: гибкий набор утилит для сравнения геномных признаков. Биоинформатика 26 , 841–842 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

67. Хайнц, С. и др. Простые комбинации транскрипционных факторов, определяющих происхождение, инициируют цис -регуляторные элементы, необходимые для идентичности макрофагов и В-клеток. мол. Ячейка 38 , 576–589 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

68. «>

    Alexa, A., Rahnenführer, J. & Lengauer, T. Улучшенная оценка функциональных групп по данным экспрессии генов путем декорреляции структуры графа GO. Биоинформатика 22 , 1600–1607 (2006).

    КАС пабмед Google ученый

Скачать ссылки

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить А. А. Ха за полезные обсуждения и сотрудников лаборатории Canzar за комментарии и предложения. Мы благодарим P. J. Shaw и M. Halic за конструктивные отзывы о разделении длины мРНК. Мы благодарим С. Эссера за отличную техническую помощь. С. Чакраборти был поддержан стипендией Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) через Высшую школу количественных биологических наук в Мюнхене. Ф.Р.Р. была частично поддержана Баварским грантом на гендерное равенство. Эта работа финансировалась исследовательским фондом TTIC (S. Canzar) и грантами Национальных институтов здравоохранения (R35NS097370 до Г.М. и R35NS116843 для HS), Фонд Симонса (575050 для HS), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) SFB-TRR 338/1 2021-452881907 (для S. Canzar), DFG Sachbeihilfe (417

6 для MLS), Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke e.V. Forschungsförderung (присужден в 2019 г. MLS), Институту фундаментальных наук (IBS-R008-D1 для AH и HC), Национальному исследовательскому фонду Кореи (2019R1C1C1006600 и 2020M3A9E4039670 для K.-JY и 2021R1C1C1010758 для AH) и финансируется H.H. Министерством науки и ИКТ Кореи, Грант для молодых исследователей, от Фонда Су Кёнбэ (для K.-JY).

Информация об авторе

Примечания автора

1. Эти авторы внесли равный вклад: Франциска Рохас Рингелинг, Шонак Чакраборти.

Авторы и принадлежность

1. Центр генов, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany

   Francisca Rojas Ringeling, Shounak Chakrabort, Akshane M.0.0202. и биофизика, Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния, США

   Кэролайн Виссерс

2. Факультет биомедицинской инженерии, Университет Иллинойса в Чикаго, Чикаго, Иллинойс, США

   Дерек Рейман

3. Факультет биологических наук, Корейский передовой институт науки и технологий (KAIST), Тэджон Республика Корея

   Ки-Хон Ли, Чан-Ву Пак и Ки-Джун Юн

4. Центр исследования РНК, Институт фундаментальных наук (IBS), Сеул, Республика Корея

   Ари Хонг и Хешик Чанг

5. Interdisciplinary Program in Bioinformatics, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea

   Ari Hong & Hyeshik Chang

6. Department of Informatics, Technical University of Munich, Garching, Germany

   Julien Gagneur

7. Institute Генетики человека, Мюнхенский технический университет, Мюнхен, Германия

   Julien Gagneur

8. Институт вычислительной биологии, Helmholtz Zentrum München, Нойхерберг, Германия

   Julien Gagneur

9. Школа биологических наук, Сеульский национальный университет, Сеул, Республика Корея

   Hyeshik Chang

10. Биомедицинский центр, кафедра физиологической химии, Людвиг-Максимилианс-Университет, Германия

    Мария Л. Сплеттер

11. Отделение неврологии и Институт неврологии им. Махони Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, США

    Guo-li Ming & Hongjun Song

Авторы

1. Francisca Rojas Ringeling

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. Shounak Chakraborty

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Кэролайн Виссерс

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

4. Дерек Рейман

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

5. Akshay M. Patel

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

6. Ki-Heon Lee

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

7. Ари Хонг

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

8. Chan-Woo Park

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

9. Tim Reska

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

10. Жюльен Гагнер

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

11. Hyeshik Chang

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

12. Maria L. Spletter

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

13. Ki-Jun Yoon

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

14. Guo-li Ming

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

15. Hongjun Song

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

16. Stefan Canzar

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

Взносы

F.R.R. и С. Канзар придумал оригинальную идею. С. Чакраборти и С. Канзар разработали методы kallisto-ls, StringTie-ls и Trintity-ls при участии Ф.Р.Р. С. Чакраборти применил методы kallisto-ls, StringTie-ls и Trinity-ls и провел все эксперименты и оценки на смоделированных данных. Ф.Р.Р. и С. Канзар внесли свой вклад в оценку смоделированных данных. Д.Р. выполнил начальное вычислительное исследование смоделированных данных (не показано). Ф.Р.Р. выполнил дифференциальный анализ сплайсинга в NPC при участии С. Канзара. Ф.Р.Р. разработал и провел эксперименты Ladder-seq при участии H.S., G.M., M.L.S. и Дж.Г. РЕЗЮМЕ. провели эксперименты RT-qPCR. К.-Дж.Ю. разводили мышей и собирали NPC. К.-Дж.Ю., Х.К., К.-Х.Л., А.Х. и К.-В.П. провели эксперименты по секвенированию с длительным чтением ONT. А.М.П., ​​С. Чакраборти, Ф.Р.Р. и Т.Р. участвовал в анализе наборов данных длительного чтения ONT. Ф.Р.Р. и С. Канзар написал рукопись при участии всех авторов. С. Канзар руководил всем проектом. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Автор, ответственный за переписку

Переписка с Стефан Канзар.

Заявление об этике

Конкурирующие интересы

Авторы не заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Примечание издателя Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Расширенные данные

Расширенные данные Рис. 1 Уменьшенная (эффективная) сложность генов в Ladder-seq.

Мы оцениваем экспрессию транскриптов в образце 1 Mettl14  KO, используя считывания kallisto on Ladder-seq, объединенные по полосам, и показываем гистограмму сложности генов, измеренную как количество экспрессированных транскриптов. В Ladder-seq мы разделяем набор экспрессированных транскриптов на 7 полос и подсчитываем количество транскриптов, содержащихся в каждой полосе, в соответствии с их аннотированной длиной (плюс 200 нуклеотидов среднего размера поли(А)-хвоста ⁴⁶ ), предполагая разрезы на 1000 1500 п.н., 2000 п.н., 3000 п.н., 4000 п.н. и 6000 п.н. Полученная гистограмма эффективной сложности генов показывает увеличение доли полос генов с низкой сложностью.

Расширенные данные Рис. 2 В силикагеле для образцов WT и KO NPC.

Для каждого аннотированного транскрипта интенсивность точки с координатой y, равной ее аннотированной длине (плюс 200 нуклеотидов среднего размера поли(А)-хвоста), показывает долю прочтений, полученных из каждой полосы (ось x), которая может быть присвоена однозначно к этому. Как и ожидалось, каждая полоса преимущественно содержит считывания транскриптов разного диапазона длин.

Расширенные данные Рис. 3 Обзор стратегии эталонного тестирования.

1. Наземный транскриптом истинности, включая распространенность и профиль ошибок, рассчитывается с помощью RSEM из образца GEUVADIS NA12716_7. 2. Прочтения имитируются с помощью транскриптома наземной истины с помощью RSEM для получения образцов секвенирования РНК с различной глубиной секвенирования. 3. Соответствующая выборка Ladder-seq получается путем разделения прочтений in silico в соответствии с массовыми функциями вероятности, оцененными из нашей выборки Ladder-seq NPC (и ее вариантов). 4. Транскрипты количественно оцениваются и собираются с помощью наших специализированных методов анализа транскриптов Ladder-seq kallisto-ls, StringTie-ls и Trinity-ls из образца Ladder-seq, в то время как их обычные аналоги анализируются на соответствующем образце RNA-seq. 5. Результаты сравниваются с наземной истиной для оценки и сравнения их точности.

Расширенные данные Рис. 4. Точность количественного определения каллисто-1 на 75 миллионах смоделированных считываний.

Приводятся средние значения по 20 симуляциям. Показана корреляция Пирсона оценочного и истинного обилия в log2 преобразованных транскриптов на миллион (TPM) и среднее абсолютное относительное различие (MARD) в зависимости от сложности гена, то есть количества транскриптов, экспрессируемых геном. Для простоты визуализации мы опускаем гены, экспрессирующие один транскрипт, многие из которых оцениваются как слабо экспрессируемые в образце GEUVADIS NA12716_7 с помощью RSEM.

Расширенные данные Рис.

чтения RNA-seq и Ladder-seq были точно выровнены с эталонным геномом (GRCh48) с использованием STAR. Чувствительность и точность StringTie-1 и его обычного аналога StringTie2 показаны как функция сложности гена, измеренная как количество экспрессированных транскриптов. Чувствительность и точность рассчитываются по отношению к тому же набору наземных расшифровок истинности, что и в меньшем наборе данных из 30 миллионов пар прочтений.

Расширенные данные Рис. 6. Точность сборки

(a) Чувствительность Trinity-ls и его традиционного аналога Trinity при 90% отсечении длины транскрипта показана как функция сложности гена, измеренной как количество экспрессированных транскриптов. (b) Общее количество правильно собранных транскриптов при различных значениях длины транскриптов. (c) Точность при различных значениях длины транскрипта.

Расширенные данные Рис. 7 Ladder-seq улучшает дифференциальный анализ реконструированных транскриптомов.

(a) Вычислительный конвейер для дифференциального анализа использования изоформ с помощью обычной РНК-секвенции и лестничной логики. Прочтения были выровнены с использованием устройства STAR aligner перед сборкой транскриптов для обоих конвейеров. ( б ) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между генами переключения, идентифицированными с помощью Ladder-seq и обычной РНК-seq. (c и e) Переключатели изоформ, идентифицированные только Ladder-seq в генах  Exo1 и Tram1l1  (между n=4 образцами WT и n=4 KO). Красные стрелки показывают расположение метилирования m ⁶ A. TCONS_00000541 и TCONS_00000542 являются новыми изоформами Exo1 , обнаруженными только с помощью Ladder-seq. TCONS_00006855 — это новая изоформа   Tram1l1 , которая была собрана обоими методами, но традиционная секвенирование РНК не смогла идентифицировать переключатель изоформы. Без информации о длине обычные чтения РНК-секвенций в полосах 2 и 3 KO были преимущественно связаны с аннотированным транскриптом в полосе 4. Гистограммы представляют среднее ± SEM; ***FDR с поправкой p<0,001. (d и f) Графики покрытия для переключения генов  Exo1  и  Tram1l1  показывая разделение прочтений от транскриптов разной длины. ( g ) Расхождение Дженсена-Шеннона для Ladder-seq и обычной РНК-seq для всех идентифицированных транскриптов, сгруппированных по относительной разнице в оценке численности обоими методами (n = 18761 для <0,5, n = 12722 для 0,5-1, n = 7918 для 1 -1,5, n=6292 при относительной разнице 1,5-2). Относительная разница определяется как абсолютная разница в предполагаемом количестве транскриптов (в TPM), деленная на среднее из двух. Определение гистограммы: нижняя и верхняя части прямоугольника соответствуют нижнему и верхнему квартилям данных, столбик — это медиана, а «усы» — это медиана  ± 1,5x межквартильный диапазон.

Расширенные данные Рис.

(a) Онтология генов для m ⁶ A Метилированные гены, содержащие переключатели изоформ. (b) Переключение изоформ в   Ptprz1   (между n = 4 образцами WT и n = 4 KO). Красная стрелка показывает расположение метилирования m ⁶ A. Гистограммы представляют собой среднее ± SEM; ***FDR с поправкой p<0,001. ( c ) Анализ онтологии генов для генов с потерей белковых доменов в KO NPC. (d) Анализ сплайсинга: количество выигрышей и потерь каждого события сплайсинга в KO NPC. A3: Альтернативный 3’-акцепторный сайт; A5: Альтернативный 5’-акцепторный сайт; ES: пропуск экзона; IR: задержка интрона; MEE: взаимоисключающий экзон; MES: пропуск нескольких экзонов. ( e ) Анализ обогащения Gene Ontology генов с потерей удержания интронов в KO NPC.

Расширенные данные Рис. 9. Сравнение секвенирования Ladder-seq и ONT-cDNA на мышиных NPC.

(a) Оранжевые столбцы показывают проверку с помощью StringTie2 (левая панель) или с помощью независимого набора данных ONT (Dong et al. ) (правая панель) транскриптов, найденных с помощью Ladder-seq и ONT-cDNA, а светло-синие столбцы показывают значения проверки для транскриптов сообщается только с помощью ONT-кДНК. Для сравнения, 32,5% транскриптов, однозначно идентифицированных с помощью Ladder-seq (средний TPM ≥ 1), также были идентифицированы в наборе данных Dong et al. (b) Гистограммы, показывающие уровни экспрессии (TPM) для транскриптов, идентифицированных как с помощью long-reads, так и Ladder-seq (зеленые прямоугольники), и для транскриптов, идентифицированных только с помощью Ladder-seq (серые прямоугольники). На левой панели показаны значения для всех транскриптов Ladder-seq с TPM выше 1 (n = 6169).идентифицированы только Ladder-seq, n = 15099 по обоим). На правой панели показаны значения транскриптов переключения Ladder-seq с TPM выше 1 (n = 905, идентифицированных только Ladder-seq, n = 2012 для обоих). Определение гистограммы: нижняя и верхняя части прямоугольника соответствуют нижнему и верхнему квартилям данных, столбик — это медиана, а «усы» — это медиана  ± 1,5x межквартильный диапазон.